NGS vs Sanger sequencing

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생물정보학 면접준비 겸 Sequencing의 역사에 대해서 좀 살펴보았다.

구글링 도중에, 기본적인 시퀀싱과 NGS에 대한 리뷰가 포함된 국내논문이 있어서 가져왔다.

bioinformatics의 새로운 기술-ngs의 현재 그리고 미래, 라는 제목으로

간단한 시퀀싱의 역사와 각 시퀀싱 기술들로 만들어지는 데이터의 사용, 연구주제 등이 나와있어서

이 분야에 대한 흥미와 기본적인 지식들을 알 수 있었다.

다운로드: http://me2.do/F7zuhYlG

시퀀싱의 세대 역사에 관한 본문의 내용을 그대로 인용해보면 다음과 같다.

1세대 Sequencing 기술은 DNA 합성 과정을 이용하여 염기서열을 밝혀낸 생거 방법을 기반으로 하였고 [2]

2세대 NGS 에서는 2005년 Roche의 GS 454-FLX System[11]과, 2007년에 Illumina의 Genome Analyzer[12]와 ABI SoLid[13]가 개발되었다. 

현재는 제 3세대 NGS기술로, PCR amplification의 필요 없이 DNA 분자합성을 기반으로 high sensitive fluorescence detection 시스템을 이용하여 Single Molecule Sequencing(SMS)을 하는 Helicos의 Helicose Genetic Analysis system이 있다[14].

2. Sanger F, Coulson AR. A rapid method for  determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 1975;94(3):441-448

11. Droege M, Hill B. The Genome Sequencer FLX  System--longer reads, more applications, straight  forward bioinformatics and more complete data sets. J Biotechnol. 2008;31;136(1-2):3-10.

12. Bennett S. Solexa Ltd. Pharmacogenomics. 2004;5(4):433-448.

13. Porreca GJ, Shendure J, Church GM. Polony DNA sequencing. Curr Protoc Mol Biol. 2006 Nov;Chapter 7:Unit 7.8

14. Thompson JF, Steinmann KE. Single molecule  sequencing with a HeliScope genetic analysis  system. Curr Protoc Mol Biol. 2010 Oct;Chapter 7:Unit7.10.

위 논문에서는 1세대부터 3세대까지 나눠놓았지만, 일반적으로 sanger sequencing과 NGS(Next generation sequencing)을 비교하기에, Sanger와 NGS의 각 차이점과 NGS가 더 우수한 장점 정도만 알고자 하였다.

1. Sanger sequencing <1세대 시퀀서>

2. NGS (Roche 로슈, Illumina 일루미나) <2세대 시퀀서, 차세대>

3. Next-NGS <3세대 시퀀서>

- Sanger sequencing

 : PCR을 통하여 샘플의 양을 증폭시킨다.

   - 두가닥의 DNA 서열들을 고온에서 열변성 과정(Denaturation)을 거쳐 분리시키고, 저온에서 DNA 앞의 primer를 결합(annealing)하여 다시 열을 올려 DNA를 합성하는 중합반응(Polymerization or extension)을 통해 DNA를 합성하는 중합반응

   : 1회 시행할 때 마다, 유전물질은 2배로 증폭되기 때문에 n회 반복하면 2^n배의 유전자를 복제할 수 있다.

   cycle sequencing을 통해 서열을 파악한다. 

cycle sequencing:

중합효소 연쇄반응에서 ddNTPs가 결합하면 DNA strands가 실제 DNA template 전체 길이만큼 확장하기 전에 반응이 종료된다.

이를 이용해서 인산기에 형광물질을 부착한 ddNTPs를 사용하여 다양한 길이의 염기가 만들어지도록 한 후, 전기영동을 통해 염기의 길이별로 정렬 한 후, 각 길이별로 띄는 색을 구분하여 sequencing 한다.

길이별로 어떤 색이 많이 나왔는지를 비교하여 시퀀싱 한다.

이 방법은 비록 NGS 방법보다 속도는 느리지만, 정확도 면에서는 훨씬 좋기 때문에, reference로써 NGS 결과를 검증하는 것으로 활용되고 있다.

- NGS (Next-generation sequencing)

1세대(Sanger), 2세대(NGS) sequencing은 PCR을 사용하는 반면, 3세대 시퀀싱은 PCR 증폭 과정을 생략하고

DNA 단일분자를 바로 시퀀싱 하여 서열을 알 수 있다는 점이다. 이는 Single Molecule, Real-Time (SMRT) 기법이라고 불린다.

 Pacific BioSciences사의 PacBio RS 시스템의 경우에는 ZMW (Zero-Mode Waveguide)라는 기술로 작은 구멍의 바닥에 고정된 DNA polymerase에 DNA 사슬이 통과하면서, 상보적으로 결합하는 염기의 형광을 인식하여 시퀀싱을 수행한다. 시퀀싱이 하루 안에 완료되며 최대 90Mb의 데이터를 생산하는데 read length가 평균 2,500-3,000bp로 매우 길다는 것이 장점이다 http://www.pacificbiosciences.com

http://blog.naver.com/jopd64?Redirect=Log&logNo=10135950313 에서 인용하였습니다.

Sanger sequencing과 NGS의 work flow가 잘 정리된 pdf 파일이 있어서 캡쳐본을 올려봅니다.

출처: http://www.corning.com/uploadedFiles/Lifesciences/PDFs/Axygen_PDFs/NGS%20Overview.pdf